PRINSIP ISOLASI DNA

Prinsip Isolasi DNA

Kolekium oleh :

Rois Muqsith

Jurusan Biologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I
PENDAHULUAN

Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain yang terdapat dalam sel. Kenapa DNA di isolasi ?

1. Mendapatkan DNA murni yang akan digunakan dalam percobaan laboratorium tertentu.
2. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
3. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern
4. Isolasi DNA genomik dalam rangka  pembuatan pustaka genomik.
5. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA,
6. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR (Arsis, 2010)

BAB II
PEMBAHASAN

Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu

1. perusakan dinding sel (lisis),
2. pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein,
3. serta pemurnian DNA (Nicholl 1993; Surzycki 2000).

 

BAHAN PROTOKOL ISOLASI DNA KROMOSOMAL BAKTERI :

-          0,5 M EDTA pH 8,0

-          25% larutan sukrosa

-          SDS 20%

-          5N-NaCl

-          Proteinase-K 5 mg/mL

-          Buffer Tris-EDTA 0,01 M pH 7,6:10 mM Tris-HCl ditambah dengan 1 mM Na2EDTA.2H2O pH 8,0

PROSEDUR KERJA :

1.      Sentrifugasi kultur bakteri sebanyak 1,5 mL dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4⁰C selama 20 menit.

2.      Suspensikan kembali pellet yang didapatkan dengan 60 µL EDTA 50mM, kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 4250rpm pada suhu 4⁰C selama 20 menit.

3.      Tambahkan pellet yang diperoleh dengan 40 µL larutan sukrosa 25% dan 10,5 µL EDTA 0,5 M pH 8. Kemudian, tambahkan dengan 1,5 µL lisozim 10 mg/mL dan inkubasi pada suhu 37⁰C selama 1 jam

4.      Tambahkan 18 µL NaCL 5M; 10,5 µL EDTA 0,5 M; 22,5 µL SDS 20%; dan 1,5 µL proteinase-K 5 mg/mL, kemudian divorteks.

5.      Inkubasi sediaan pada suhu 50⁰C selama 1 jam. Kemudian, tambahkan kloroform (1:1) dan kocok pelan selama 20 menit. Selanjutnya sentifugasi dengan kecepatan  4250rpm pada suhu 4⁰C selama 30 menit.

6.      Pindahkan supernatant (larutan yang terlihat bening) ke tabung baru yang berisi 2x volume etanol dingin. Sentrifugasi dengan kecepatan 10000rpm selama 5 menit. Selanjutnya, tambahkan pellet dengan 30 µL buffer TE pH 7,6.

7.       Larutan DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut.

BAHAN YANG DIGUNAKAN UNTUK ISOLASI TANAMAN ;

1. CTAB Buffer ekstrak
2. PCI
3. Nitrogen cair
4. 7,5 M ammonium sulfat
5. Etanol 70%
6. Buffer TE pH 7,6
7. Larutan etenol:kloroform
8. Ambil 1 mL etanol 96% dan campurkan dengan 24 mL kloroform

PROSEDUR KERJA :

1. Timbang 0,1 g daun muda, dan bekukan daun muda tersebut dengan nitrogen cair
2. Segera gerus dalam mortar sampai halus seperti bubuk
3. Tambahkan 700µL buffer ekstrak, pindahkan ke tabung 1,5 mL kemudian divorteks.
4. Inkubasi tabung 1,5 mL yang berisi homogenate di dalam waterbath bersuhu 65⁰C selama 30 menit.
5. Sentrifugasi dengan kecepatan 13000rpm pada suhu 4⁰C selama 10 menit.
6. Pindahkan supernatant yang diperoleh ke dalam tabung 1,5 mL dan tambahkan dengan PCI sejumlah volume yang sama, kemudian divortex
7. Ambil Supernatanya dan peletnya dibuang kemudian Pindahkan     ketabung effendof baru, Presipitasi (diendapkan) dengan iso         propanol dua kali jumlah volume. Homogenkan dan Sentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit
8. Ambil Peletnya dan buang supernatannya kemudian bilas dengan    etanol 70% sebanyak 1 ml, homogenkan dan sentrifugasi 10.000 rpm   selama 5 menit.
9. Ambil Peletnya dan buang supernatannya, kemudian dikeringanginkan dan ditambah dengan aquabides
10.  diperoleh sampel DNA

UJI KUALITATIF DAN KUANTITATIF :

Metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan purifikasi fragmen DNA adalah menggunakan elektroforesis gel agarosa.

BEBERAPA HAL YANG DAPAT TERJADI KETIKA ISOLASI DNA: 

•  DNA patah-patah selama proses Isolasi
• DNA terdegradasi oleh enzim nuclease
•   Terjadi Kontaminasi oleh polisakarida
• Metabolit sekunder ikut terisolasi(Fatchiyah dkk., 2012)